微生物多样性专题 | 扩增子测序分析实战（二）数据库整理之SILVA
文：向屿 | 编辑：湖心
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微生物多样性专题
扩增子测序分析实战（二）
数据库整理之SILVA
今天要继续跟大家介绍一个微生物常用数据库SILVA，加上本期，已经连续四期在介绍微生物的数据库了，可能大家有些审美疲劳了，没关系，后面还有...
老规矩，先上官方主页：
https://www.arb-silva.de/
SILVA是一个rRNA基因序列的综合数据库，收录原核和真核微生物的小亚基rRNA基因序列（简称SSU，即16S和18SrRNA）和大亚基rRNA基因序列（简称LSU，即23S和28SrRNA）。
LSU: Large subunit (23S/28S ribosomal RNAs)
SSU: Small subunit (16S/18S ribosomal RNAs)
目前SILVA最新数据库版本为SILVA 128，最新一次更新时间为2016年9月28日，数据库下载路径：
https://www.arb-silva.de/no_cache/download/archive/current/Exports/
128版本数据统计如下：
在上表中，以SSU为例，不同的数据过滤条件得到不同的子数据库（Parc、Ref和NR 99），接下来一一讲解：
Parc：最全也是最冗余的数据库，需要满足如下条件：
1、 alignment identity value >= 50
2、 alignment quality value >= 40
3、 basepair score or sequence quality >= 30
Ref：在Parc的基础上进行过滤，需要满足如下条件：
1、 Bacteria and Eukarya sequences >= 1,200 bases；Archaea sequences >= 900 bases
2、 alignment identity value >= 70
3、 alignment quality value >= 50
4、 basepair score or sequence quality >= 30
Ref NR 99：
SSU Ref NR 99是专门为了微生物研究而生的. 将 SSU Ref 加上大规模测序计划 HSM/MWM/GNHM 得到的序列, 使用USEARCH以 99% 相似度为标准聚类, 只留下相似度低于 99% 序列, 希望创造一个能代表微生物多样性, 且去冗余的数据库。【OTU聚类分析中，我们还会讲到USEARCH】
所以为了提高分析准确性，减少冗余，我们将使用Silva 128版本的NR99数据，可以直接用该链接下载：
https://www.arb-silva.de/fileadmin/silva_databases/release_128/Exports/SILVA_128_SSURef_Nr99_tax_silva_trunc.fasta.gz
解压后是一个序列文件，名为SILVA_128_SSURef_Nr99_tax_silva_trunc.fasta
可以看到NR99数据集中共包含645151条序列，与上表统计一致，序列文件格式如下：
1、SILVA_128_SSURef_Nr99_tax_silva_trunc.fasta中同时包含16S和18S两种序列，根据实际需求，可以拆分成16S的数据库和18S的数据库。
2、与RDP数据库的序列文件类似，但是稍有不同的地方在于，RDP数据库中给定了每条序列的注释，且明确其注释所属的水平（界门纲目科属种），但是上示SILVA的注释并没有明确其注释物种分别属于哪些分类水平。【哈，有些盆友可能已经反应过来上期taxdmp数据库的用处了，别着急整理文件，接着往下看】
3、发现一个有趣的现象，同一条序列在SILVA和NCBI上出现了较大差别的注释：
如上，同一条序列，在SILVA自带的序列注释中为细菌，而在NCBI中的注释则为真核，从比对结果来看，NCBI的注释结果更准确，故在整理SILVA的数据库时，使用SILVA的序列，但同时使用NCBI的注释【而不是SILVA序列文件中自带的注释】，SILVA官方提供了NCBI对应注释信息的下载：
https://www.arb-silva.de/fileadmin/silva_databases/release_128/Exports/taxonomy/taxmap_ncbi_ssu_ref_nr99_128.txt.gz
解压缩后数据格式如下：
4、同样，该注释信息中无法明确得知物种的分类水平，所以很容易联想到，我们还需要一个文件，该文件能够知道每个物种对应的rank信息，这就是我们上期为什么要提到taxdmp数据库。【错过上期和忘性较好的小伙伴自行补习吧~】
5、关于该文件中含有<>格式的物种注释，我们在上期也有提到，是因为该物种名称有重复的情况下，会用<>进一步区分，而它们对应的rank可能是不同的，所以一定要考虑进去，否则可能会得到错误的rank！！
此时，我们拥有了以下文件：
1、SILVA下载的原始序列文件 SILVA_128_SSURef_Nr99_tax_silva_trunc.fasta；
2、序列对应的物种注释文件 taxmap_ncbi_ssu_ref_nr99_128.txt；
3、整理NCBI taxdmp得到的物种对应rank文件 Tax_Rank_Annotation；
需要注意的是，Tax_Rank_Annotation是更新的，但是taxmap_ncbi_ssu_ref_nr99_128.txt 的更新可能跟不上，所以会造成两者关联的时候，某些物种会对不上。以 Gemmata sp. IIL30 为例，其在早前的names.dmp中是存在的，如下：
但是在更新names.dmp生成的Tax_Rank_Annotation里不存在该物种，是因为在新的names.dmp中该物种改名了：
同理，还有其他的很多物种存在更换名称的情况，故需要对此进行调整，即让 Tax_Rank_Annotation【上期 NCBI taxdmp 数据库整理获得】中包含所有可能出现的物种名称及其对应的rank信息！然后再在最终的物种注释文件中将所有名称统一成 scientific name 就完成啦！
总结一下整理步骤：
1、提取SILVA_128_SSURef_Nr99_tax_silva_trunc.fasta中的序列；
2、由1中的序列对应taxmap_ncbi_ssu_ref_nr99_128.txt中的物种注释；
3、基于 Tax_Rank_Annotation给2中的物种注释添加rank信息，并将所有物种名称换成scientific name；
4、根据实际需要，可考虑将16S和18S的数据库拆分开。
最终文件列表如下：